MECCANISMI EPIGENETICI IN PATOLOGIA UMANA:
RESPONSABILITÀ NELL’ATEROGENESI
Enrico Bologna
Specialista in Medicina Interna, Gastroenterologia e Patologia generale.
Già Primario Ospedale Fatebenefratelli, Isola Tiberina, Roma.
Libero docente in Patologia Medica, Università di Roma “Sapienza”.
Riassunto.
Modificazioni epigenetiche come metilazione del DBNA, acetilazione e metilazione degli istoni e microRNA possono potenziare, ridurre o silenziare l’espressione genica contribuendo alla patogenesi di molte malattie. In questa sede verranno passati in rassegna soprattutto im meccanismi epigenetici coinvolti nella malattia aterosclerotica.
Summary.
Epigenetic changes (DNA methylation. histone methylation and acetylation, microRNA) may upregulate, downregulate or silentiate gene expression.These alterations may be involved in the pathogenesis of many disorders. In this paper the role of epigenetic mechanisms in atherogenesis will be reviewed.
Negli anni tra il 1930 e il 1950 l’agronomo russo Trofim Denisovič Lysenko, a seguito di ricerche relative all’influenza di fattori ambientali sulla crescita dei cereali, enunciò una sua teoria secondo la quale i caratteri ereditari non sono dipendenti dai cromosomi bensì da una interazione fra organismo ed ambiente. Nonostante l’iniziale opposizione della scuola genetica russa, le condizioni politiche ed economiche (in particolare la volontà di tentare ogni mezzo per incrementare la produzione agricola) fecero sì che questa teoria dell’ereditabilità dei caratteri acquisiti, nonostante la mancanza di qualsiasi conferma sperimentale, avesse seguito in URSS fino ad epoca relativamente recente.
Il ricordo della “teoria” di Lysenko torna alla memoria perché negli ultimi venti anni sono state pubblicate numerose osservazioni relative alla possibilità che modificazioni ereditabili del fenotipo possano realizzarsi, in assenza di qualunque alterazione della sequenza del DNA, per variazioni dell’espressione genica 27. Si tratta di fenomeni ereditari in cui il fenotipo viene determinato in parte più o meno rilevante dalla sovrapposizione al genotipo di modificazioni che ne influenzano il comportamento funzionale. Si genera in altri termini un cambiamento che pur essendo ereditabile non comporta l’alterazione della sequenza nucleotidica di un gene, ma ne modifica l’attività..
Si è così sviluppata una branca della genetica, denominata epigenetica (dal greco επι, epi = “sopra” e γεννετικσς= Gennetikos, “ereditario”), riguardante i cambiamenti mitotici e meiotici ereditabili che non possono essere spiegati da modifiche della sequenza del DNA, cambiamenti che sono definiti epimutazioni.
Nel 2008, durante il Cold Spring Harbor Meeting, è stata concordata una definizione di caratteristica epigenetica così formulate: "fenotipo stabilmente ereditabile derivante da una alterazione cromosomica non connessa a variazioni del DNA 4.
Queste epimutazioni si mantengono per tutta la durata di vita delle cellule interessate e possono essere trasmesse alle successive generazioni cellulari senza modificazione della sequenza di DNA.
I processi responsabili delle epimutazioni possono aver luogo sia prima sia dopo la trascrizione. Nel primo caso sono rappresentati principalmente da metilazione del DNA, cui si lega con legame covalente (quindi reversibile) un gruppo metilico proveniente dal donatore metilico universale S-adenosilmetionina (SAM) nella posizione 5 del residuo citosina del dinucleotide CpG (Cytoeine-phosphate-Guanidine). Il fenomeno è dovuto all’intervento dell’enzima specifico DNA methyltransferase (DNMT). La ipermetilazione del DNA determina il “silenziamento” del gene interessato, mentre l’ipometilazione ne provoca attivazione 62.
Epimutazioni possono aver luogo anche in fase prost-traslazionale: si tratta di modificazioni della cromatina per acetilazione, metilazione, ubichinazione, fosforilazione e SUMOylation (*) degli istoni che la costituiscono. Ricordiamo che con la denominazione cromatina si indica il complesso di DNA, RNA e proteine da cui sono composti i cromosomi e le cui alterazioni possono modificare l’espressione genica. Questi processi, alterando l’accessibilità alle regioni del genoma cui si legano proteine ed enzimi deputati all’espressione genica, determinano alterazioni dell’espressione stessa. E’ stato inoltre dimostrato che le modificazioni degli istoni sono in grado di alterare risposte dell’immunità innata quali l’espressione di peptidi antimicrobici 23.
Oltre a questi processi possono realizzarsi vari altri meccanismi ereditabili di regolazione genica post-trascrizionale, fra cui in particolare la sintesi di ”microRNA” non codificanti che si legano ai corrispondenti RNA messaggero provocandone degradazione o inibizione7.
Epimutazioni possono dipendere anche da fattori ambientali, come è dimostrato da studi su gemelli monozigoti il cui quadro epigenetico, identico alla nascita, si puòl modificare
con l’età così che uno dei due può risultare per questo motivo più a rischio per determinate malattie nonostante l’identità della sequenza del DNA20. Conferme a queste osservazioni sono venute da studi sperimentali sui topi, nei quali al deficit di alcune sostanze (acido folico, l-metionina, colina) ha fatto riscontro la comparsa di alterazioni reversibili di DNMT1 e di metilazione di CpG e, in caso di deficit protratto, di carcinoma epatico 22.
Tutti questi eventi epigenetici possono aver luogo sia nella fase dell’embriogenesi sia successivamente, per tutta la durata della vita delle cellule, e molte indagini hanno dimostrato che tali processi sono coinvolti nella patogenesi di numerose condizioni morbose, in particolare quelle a carico dell’apparato cardiovascolare, del sistema nervoso e del metabolismo oltre che nella carcinogenesi 46.
L’interesse per lo studio dei processi epigenetici nasce dalla considerazione che i processi stessi sono reversibili e in quanto tali le relative conseguenze sono potenzialmente prevenibili o trattabili 35,37.
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(*)Si indica con questo nome il legame covalente fra gli istoni e una famiglia di piccole proteine (Small Ubiquitin-like Modifier, SUMO) distaccatesi da altre molecole proteiche; anche questo tipo di legame comporta modificazioni funzionali dei geni interessati.
Delle numerose malattie in cui la responsabilità di modificazioni epigenetiche è oggetto di maggiori attenzioni fanno parte ovviamente le neoplasie, nella cui eziopatogenesi rientrano fattori sia genetici sia ambientali. Nella carcinogenesi molti oncogeni vengono attivati da mutazioni 21,36,50,52 .
D’altra parte molti geni con funzione di tumor soppressor in quanto inibitori del ciclo cellulare ovvero pro-apoptotici vengono “silenziati” dalla metilazione dei siti CpG presenti in alcune delle loro regioni. In molte neoplasie, come quelle mammarie ed ovariche, sono stati rilevati geni soppressor silenziati.
L’enzima DNMT1 [DNA(cytosine-5).methyltransferase1] è codificato dal gene DNMT1, la cui espressione, connessa con lo svolgimento del ciclo cellulare, appare più elevata che di norma in quasi tutti i tessuti neoplastici. A differenza dalle mutazioni genetiche coinvolte nella carcinogenesi, queste alterazioni sono reversibili . Si può pertanto ipotizzare che la riespressione dei geni tumor soppressor silenziati possa rendere le neoplasie più sensibili ai farmaci citotossici, o quanto meno rispondenti a dosi più basse di essi 51.
La responsabilità di alterazioni epigenetiche è stata dimostrata anche in malattie neurologiche. Nei precursori neuronali molti geni connessi con lo sviluppo e la differenziazione sono silenziati da metilazione di CpG. La regolazione delle proteine che si legano al CpG metilato è soggetta a mutazioni, duplicazioni e inserzioni da cui dipende ad esempio la sindrome di Rett (grave ritardo mentale legato al cromosoma X); molto interessante il rilievo, effettuato nell’animale, che le modificazioni del CpG proprie di questa malattia sono almeno in parte reversibili 25.
Modificazioni epigenetiche possono aver luogo durante tutta la vita e sono state messe in rapporto con l’invecchiamento cerebrale, con i disturbi della memoria e con le modificazioni della plasticità sinaptica 29. Le alterazioni che ne conseguono si accrescono nel corso degli anni 53 e assumono rilievo in varie malattie neurodegenerative come la Malattia di Parkinson e la Corea di Huntington 14,36.
Varie osservazioni hanno portato a sospettare l’esistenza di meccanismi epigenetici nella patogenesi dell’asma che infatti, in gemelli omozigoti, è presente in entrambi i soggetti in non più della metà dei casi 42. In effetti nell’asma intervengono complesse interazioni tra genetica ed ambiente, che fanno sospettare modificazioni epigenetiche del genoma: un esempio è dato dalla dimostrata interazione tra fumo materno in corso di gravidanza e attività dell’antagonista del recettore di Interleukina-1 (IL1RN) nel neonato, con significativo aumento del rischio di asma 47. Al contrario, l’esposizione in utero ad alcune endotossine sembra svolgere effetto protettivo 15.
Molti studi sulla genetica dell’asma, del resto, hanno dimostrato l’esistenza di varie deregolazinone di geni spiegabili solo con alterazioni epigenetiche 3.
La responsabilità di modificazioni epigenetiche è stata chiamata in causa anche nelle malattie metaboliche, in particolare nel diabete mellito tipo 2 e nell’obesità. Per quanto riguarda il diabete, modificazioni epigenetiche possono aver luogo nel periodo fetale in rapporto alla nutrizione materna, con il silenziamento per metilazione del Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox 1), noto anche come Insulin promoter factor 1. E’ questo un fattore di trascrizione necessario per lo sviluppo e per la maturazione delle cellule beta. Anche gli episodi iperglicemici transitori possono indurre protratte alterazioni della metilazione del gene di NFkB-p65, una subunità del complesso di trascrizione NF-k-B, che è spesso associato a complicazioni infiammatorie del diabete 6.
Anche la predisposizione all’obesità può dipendere da fattori epigenetici attivi al momento del concepimento e durante la vita fetale e neonatale. Molti studi su mammiferi indicano che la predisposizione all’obesità può essere favorita non solo dalle caratteristiche quantitative e qualitative della nutrizione materna in corso di gravidanza, ma anche dalla linea paterna attraverso tutti i già descritti meccanismi epigenetici. Un recente editoriale su questo argomento è stato pubblicato su NEJM 45. In questa sede basterà sottolineare che sia in mammiferi sia in insetti l’alimentazione dei genitori può condizionare il rischio di disfunzione metabolica nella prole. L’esistenza di meccanismi epigenetici alla base di questo fenomeno è stata confermata con tecniche che hanno consentito di osservare il silenziamento di specifici loci sul cromosoma X associato a variazioni quantitative dell’assunzione paterna di glicidi. Il fenomeno è risultato dipendente da alterata codificazione di proteine enzimatiche da cui dipende la conformazione della cromatina. Successive ricerche su tessuto adiposo umano hanno permesso di stabilire che il deficit epigeneticamente indotto di una di queste proteine, denominata Su(var), costituisce un marcatore biologico del rischio di obesità 44.
Le aree di interesse su cui sono in corso ricerche in ambito epigenetico sono come si è visto numerosissime. In questa sede, considerando l’impatto delle malattie cardiovascolare sulla salute delle popolazioni, può essere utile portare l’attenzione sulle modificazioni epigenetiche connesse con la patogenesi dell’aterosclerosi.
Nelle cellule presenti in lesioni aterosclerotiche umane sono state rilevate notevoli riduzioni della metilazione del DNA 1. In soggetti coronaropatici è stata osservata ipermetilazione del gene DDAH2, da cui dipende sviluppo e funzione delle cellule progenitrici endoteliali 41. Un meccanismo aterogeno indirette è rappresentato dall’aumento dell’omocisteina plasmatica, da cui può dipendere ipometilazione globale del DNA 11. L’effetto aterogeno dell’aumentata concentrazione plasmatica di LDL può essere mediato anche dalla inibizione del fattore endoteliale KLF2, essenziale per l’omeostasi vascolare endotelio-dipendente, che perde la sua funzione se ipermetilato 31.
Anche modificazioni epigenetiche degli istoni possono intervenire nella patogenesi dell’’aterosclerosi: modificando l’espressione del gene che codifica per la sintetasi endoteliale del monossido di azoto (endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) 19; lo stesso effetto può essere determinato anche dall’aumento delle LDL ossidate 17. Il grado di acetilazione degli istoni, inoltre, è determinante nella trascrizione della sequenza del gene da cui dipende la proliferazione delle miocellule vascolari lisce 10. L’acetilazione degli istoni dipende dall’equilibrio esistente fra due famiglie di enzimi, Histone Acetyjtransferase (HATs) e Histone Deacetylase (HDACs): Ricerche sperimentali hanno dimostrato che la disfunzione di HDAC2 e di HADA3 favorisce l’infiammazione e determina la comparsa di lesioni aterosclerotiche 28,60.
Molti studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che anche modificazioni epigenetiche dei microRNA possono intervenire nella patogenesi delle lesioni aterosclerotiche. Ad esempio, miR-33 inibisce i geni da cui dipende la capacità di espellere il colesterolo delle cellule, il metabolismo delle HDL, l’ossidazione dei lipidi e il metabolismo glicidico. Nel topo il deficit di miR-33 si associa a riduzione della progressione delle lesioni aterosclerotiche indotte 5, 26,54.
Altri microRNA coinvolti nella patogenesi dell’aterosclerosi sono miR-126, che influenza la funzione endoteliale via TNFalfa, da mjR-21 che agisce sulla proliferazione cellulare e sull’apoptosi endoteliale e da miR-145 che condiziona la differenziazione, la proliferazione e la contrattilità dei miociti vascolari 12.
L’importanza dell’epigenetica nell’inizio e nella progressione dell’aterosclerosi, come anche di altre condizioni tra cui neoplasie e malattie autoimmuni, insieme con la dimostrata reversibilità dei meccanismi epigenetici, ha dato luogo a molti studi volti a ricercare mezzi capaci di influenzare tali meccanismi, in particolare quelli dipendenti dalle DNA metiltransferasi (DNMTs) e dalle istone deacetilasi (HDACs) 59.
Inibitori di DNMTs
5-aza-2-deoxyicytidine
In modelli animali 5-aza-2-deoxyicytidine (5-azadC) è stata ampiamente studiata per valutarne la capacità protettiva nei confronti di neoplasie. In queste ricerche è stato osservato che la sostanza possiede anche effetti antiaterosclerotici dipendenti dalla capacità di inibire l’infiammazione endoteliale e l’attivazione dei macrofagi. Si è inoltre rilevato che 5-azadC svolge azione inibente sul Liver X Receptor alfa (LXRα) e sui Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma (PPARγ1), entrambi attivi sulla funzione dei macrofagi e sull’omeostasi del colesterolo 9,16.
Gallato di epigallocatechina
Epigallocatechin-3-gallate, EGCG) è un polifenolo presente nel tè (soprattutto tè verde) che forma ponti idrogeno con vari residui di DNMT, inibendone l’attività e svolgendo azione protettiva cardiovascolare. Questa si esprimerebbe attraverso la protezione dall’ipermetilazione del gene DDAH2, la cui attività è protettiva contro l’apoptosi che l’omocisteina induce a carico delle cellule endoteliali 59.
Inibitori dell’acetilazione degli istoni
Dall’equilibrio funzionale degli enzimi HATs e HDACs dipendono, come già ricordato, vari processi che influenzano la componente infiammatoria dell’aterosclerosi, la proliferazione delle miocellule vascolari e lo stato della matrice.
Inibitori della istone deacetilasi.
Vari composti naturali e sintetici possono legarsi alla “tasca catalitica” degli HDACs inibendone l’attività, ma per la maggior parte l’inibizione non è specifica per i vari sottotipi di HDAC. Tra i numerosi inibitori presi in esame Trichostatin A (TSA), che è risultata efficace nell’inibire la proliferazione di cellule neoplastiche, si è dimostrata altrettanto efficace nei confronti della proliferazione delle miocellule vascolari. Questo effetto sarebbe mediato dalla capacità di ostacolare il ciclo cellulare in fase G1-S 43.
In modelli di aterosclerosi carotidea il trattamento con TSA è risultato capace di esercitare una forte inibizione sulla formazione di neointima e sulla conseguente stenosi 30, risultato questo contrastante con il rilievo di una azione proaterogena mediata dalla riduzione operata da TSA sulla tioredoxina 1 55. D’altra parte TSA stimola il recettore CLA-1/WSRBI, la cui espressione promuove il trasporto inverso del colesterolo 2,8.
La capacità di inibire la proliferazione delle miocellule vascolari è posseduta anche dal Butirrato, acido grasso a catena corta derivante dalla fermentazione intestinale delle fibre alimentari, che agirebbe con un meccanismo differente e maggiormente inibitorio rispetto al TSA 38.
Un’altra deacetilasi, Sirtuin 1, è una proteina NAD-dipendente codificata dal gene che codifica per SIRT1. E’ questo un enzima che deacetila le proteine che contribuiscono alla regolazione cellulare in risposta a fattori di stress eche si ritiene coinvolta nei processi dell’’invecchiamento, nel metabolismo e nella resistenza allo stress ossidativo in quanto capace di deacetilare varie proteine istoniche e non istoniche 18.
Vari studi hanno dimostrato che SIRT1 svolge ruolo protettivo vascolare regolando (analogamente a 5-azadC) l’attività del recettore epatico LXRα, che svolge un fondamentale ruolo regolatore della funzione dei macrofagi, (nei quali controlla l’efflusso del colesterolo), dell’omeostasi lipidica e dell’infiammazione 32. Conferme sono venute da studi sperimentali in vitro e in vivo sui topi, nei quali l’attivazione di SIRT1 ottenuta con il preparato SRT3025 ha ridotto la secrezione epatocellulre di Proprotein convertase subtilisin/kezin type9 (Pcsk9) e la concentrazione plasmatica di colesterolo 39. Studi clinici condotti con un altro attivatore di SIRT1, SRT2104, hanno dimostrato che questo composto riduce la concentrazione plasmatica di colesterolo totale e HDL-C 56.
Resveratrolo.
Resveratrolo (3,5,4'-triidrossi-trans-stilbene) presente nella buccia degli acini di uva nera, è un fenolo non flavonoide cui da tempo sono riconosciute proprietà protettive nei confronti dell’apparato cardiovascolare. Si tratta anche per questo composto di un attivatore di SIRT1 60. E’ stato osservato che il trattamento con Resveratrolo riduce lo stress ossidativo indotto dal fumo di sigarette e che questo effetto protettivo scompare negli ratti knochout per SIRT1 13.
Trattamenti attivi sui miRNA
Per il già ricordato ruolo svolto dai miRNA nella fisiopatologie dell’aterosclerosi vari studi sono stati condotti per inibirli. Il trattamento con l’inibitore di miR33 2’-fluoromethoxyethil (2’F/MOE) determina, in topi alimentati con dieta occidentale, aumento delle HDL e del trasporto inverso del colesterolo, con il risultato di una riduzione delle placche aterosclerotiche che assumono inoltre caratteri di maggiore stabilità quali ridotto accumulo di macrofagi e di lipidi, ridotta espressione dei geni flogistici a maggior contenuto in collagene 48. Questi risultati non sono stati confermati quando miR33 è stato somministrato a topi con deficit del recettore per le LDL
Altre prospettive sembrano essere offerte dall’aumento dei livelli di alcuni miRNA. L’iniezione endovenosa in topi di miR-145 lentivirus (*) diretto contro le miocellule vascolari determina marcata riduzione e stabilizzazione delle placche aterosclerotiche sperimentalmente indotte 33 Sempre nei topi, l’iniezione endovenosa di miRNA181b incapsulato in liposomi inibisce l’attivazione del Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB) (**) nelle cellule endoteliali con riduzione dell’accumulo di leucociti e rallentamento del processo ateromasico 58.
In conclusione, appare oggi certo che modificazioni epigenetiche quali metilazione del DNA, modificazioni degli istoni ed espressione di microRNA con funzione regolatoria possono trasformare stimoli ambientali in espressioni genetiche ereditabili se il marker epigenetico viene trasmesso attraverso la meiosi. Pertanto l’effetto di patogeni vari, di parassiti, di sostanze chimiche o o di agenti ambientali può influenzare la fecondità, la longevità o la predisposizione a malattie per più generazioni,
Per lo studio di tutti questi aspetti di plasticità fenotipica controllata da meccanismi epigenetici che producono distinte varianti a partire dallo stesso fenotipo per riprogrammazione trascrizionale si prestano molto bene gli studi sugli insetti (dalle api alla Drosofila, dai coleotteri ai bachi da seta). Gli insetti, infatti, oltre a presentare notevoli affinità con gli umani in termini di meccanismi epigenetici e di modalità di trasmissione dei
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(*) Si tratta di un sottogenere di retrovirus caratterizzati dall'estrema lentezza dei processi replicativi, tanto che talvolta pssono avvenire a distanza di anni dal contagio, ma privi di potenziale oncogeno. I lentivirus oggi sono utilizzati come vettori di geni in terapia genica
(**) Questo fattore è interessato in tutte le reazioni cellulari agli stimoli, ( stress, citochine, radicali liberi, irradiazione con ultravioletti e attacco proveniente dagli antigeni dei batteri o virus).[1] NF-κB svolge un ruolo chiave nella regolazione della risposta immunitaria
segnali cellulari, offrono rispetto ad altri modelli notevoli vantaggi economici, si riproducono rapidamente e non sollevano problemi etici40. Dagli studi condotti sugli insetti è perciò lecito attendersi molti e più rapidi progressi nella conoscenza dei meccanismi epigenetici coinvolti in molte malattie e in particolare nell’aterosclerosi.
La prevenzione della malattia aterosclerotica viene oggi attuata con modificazioni delle abitudini di vita e con farmaci attivi sui fattori di rischio. I progressi nella conoscenza dei meccanismi aterogeni di tipo epigenetico lasciano intravedere la possibilità di nuove e sorprendenti strategie di intervento.
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